クロストリジウム・アセトブチリカムにおけるブタノール合成の欠損電子経路の分子特性解析

Nature Communications volume 13、記事番号: 4691 (2022) この記事を引用

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クロストリジウム アセトブチリカムは、n-ブタノールの再生可能生産のための有望な生体触媒です。 ブタノール収量を増加させるためのいくつかの代謝戦略がすでに開発されており、その多くは炭素経路の方向転換に基づいています。 しかし、フェレドキシン NADP+ レダクターゼとフェレドキシン NAD+ レダクターゼの両方の活性が、溶媒生成条件下でのブタノール合成に必要な NADPH と追加の NADH の生成に必要であることは、これまでに証明されており、そのコード遺伝子は依然として不明である。 今回我々は、両方の活性に関与するタンパク質を精製、同定し、部分的に特徴付けし、逆遺伝的アプローチを通じて同定された酵素のブタノール合成への関与を実証します。 さらに、ブタノール生成の収量は、フェレドキシン NADP+ レダクターゼをコードする遺伝子 CA_C0764 およびフェレドキシン NAD+ レダクターゼをコードする bcd オペロンの発現レベルによって制限されることを示します。 これらの酵素を代謝工学戦略に組み込むことにより、ホモブタノロゲン性 C. アセトブチリカム株を開発する機会がもたらされます。

Clostridium acetobutylicum は、グラム陽性の芽胞形成嫌気性細菌で、さまざまな糖や多糖類を有機酸 (酢酸塩と酪酸塩) や溶媒 (アセトン、ブタノール、エタノール) に変換できます。 バルクケミカルのアセトンとブタノール 1,2,3 の工業生産における重要性と、エタノールに比べていくつかの利点を持つ有望なバイオベースの液体燃料である n-ブタノールの生産における潜在的な使用の可能性のため、多くの研究が焦点を当てています。 i) 溶媒生成の制御を理解する 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、および (ii) この微生物を代謝工学的に操作して高収率のアルコールを生産する 16、17、18。

C. acetobutylicum のリン酸塩制限ケモスタット培養物の溶媒生成代謝の特性評価に対するグローバル システム生物学的アプローチを使用して、アセチル CoA からブタノールへの変換に含まれる 6 つのステップ (図 1) が以前に特性評価されました 19。クロトニル-CoAのブチリル-CoAへの還元に関与するのは、BCD複合体（bcd、etfB、およびetfA、bcdオペロンによってコードされる）であることが示されており、これは2モルのNADHを消費し、1モルの還元型フェレドキシンを生成する分岐酵素である。ブタノール生成の最後の 2 段階は、AdhE1 が NADH 依存性アルデヒド デヒドロゲナーゼ活性を介して触媒し、BdhB、BdhC、BdhA が NADPH 依存性ブタノール デヒドロゲナーゼ活性を介して触媒されることが示されました。 アセチルCoAからのブタノール合成に必要なNADPHと追加のNADHを生成するには、フェレドキシン-NADP+レダクターゼとフェレドキシン-NAD+レダクターゼの両方の活性が必要であることが実証されたため、これらの結果は電子束分布に強い影響を与えました（図2）。 19. これらの酵素の活性は以前に C. acetobutylicum で検出されていました 6,20 が、コードする遺伝子は不明のままでした 19,21。 フェレドキシン NADP+ レダクターゼ酵素 (FNOR) (EC 1.18.1.3) は、原核生物から真核生物までのさまざまな好気性生物、特に植物に分布しています 22 が、どのクロストリジウム菌種からも精製および特性評価されたことはありません。 対照的に、プロトン輸送（Rnf）およびフェレドキシン依存性トランスヒドロゲナーゼ（Nfn）と共役したフェレドキシン依存性 NAD+ 減少は、いくつかのクロストリジウム菌種において分子的観点から特徴付けられていますが、C. acetobutylicum ではホモログは見つかっていません 23,24,25。 さらに、C. acetobutylicum は、この経路の最初の重要な酵素であるグルコース-6-P デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が欠損しているため、酸化的ペントースリン酸経路によって NADPH を生成できないことが示されました 19,26。

緑色のボックスは酸生成条件下での一次生成物を示し、赤色のボックスは溶剤生成条件下での一次生成物を示します。 赤と斜体の文字は対応する遺伝子を示します。 ack酢酸キナーゼ、adcアセト酢酸デカルボキシラーゼ、adhE1アルデヒドデヒドロゲナーゼ、adhE2二官能性アルデヒド/アルコールデヒドロゲナーゼ、alsDアルファ-アセト乳酸デカルボキシラーゼ、alsSアセト乳酸シンターゼ、bcdブチリル-CoAデヒドロゲナーゼ、bdhブタノールデヒドロゲナーゼ、buk酪酸キナーゼ、crt クロトナーゼ、ctfAB CoA トランスフェラーゼ、etf 電子伝達フラボタンパク質、hbd 3-ヒドロキシブチリル-CoA デヒドロゲナーゼ、hyd ヒドロゲナーゼ、fnor フェレドキシン-NAD(P)+ オキシドレダクターゼ、pdc ピルビン酸デカルボキシラーゼ、pfor ピルビン酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼ、pta ホスホトランスアセチラーゼ、ptb ホスホトランスブチラーゼ、 l チオラーゼ、gapC NADH 依存性グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、gapN 非リン酸化 NADPH 生成グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、Fd ox は酸化型フェレドキシンを表し、Fd red は還元型フェレドキシンを表します。