シングル

Scientific Reports volume 13、記事番号: 10093 (2023) この記事を引用

584 アクセス

1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

好中球細胞外トラップ（NET）を他の形態の細胞死から区別する決定的な生物学は未解決であり、NETを明確に識別する技術は依然としてとらえどころのないままである。 ラマン散乱測定は、脂質やタンパク質などの成分の特徴的な結合振動に基づいて、細胞の分子構成の全体的な概要を提供します。 私たちは、単一細胞からのスペクトルを迅速に測定できるカスタム構築の高スループットプラットフォームを使用して、NET からラマンスペクトルを収集し、壊死細胞を凍結/解凍しました。 NET からのラマン スペクトルの主成分分析により、NET は形態が類似しているにもかかわらず、壊死細胞と明確に区​​別され、基本的な分子の違いが実証されました。 対照的に、NET 分析、免疫蛍光顕微鏡、細胞外 DNA、および ELISA に使用される古典的な技術では、これらの細胞を区別できませんでした。 さらに、ラマンスペクトルの機械学習分析では、ホルボールミリステートアセテート（PMA）誘発性のNETとは対照的に、リポ多糖（LPS）誘発性のNETに微妙な違いがあることが示され、NETの分子組成が使用する刺激剤に応じて異なることが実証されました。 この研究は、NET を他の種類の細胞死から、またその誘導経路によって区別する際のラマン顕微鏡法の利点を実証しています。

好中球細胞外トラップ (NET) は、核の破壊と雲またはひものような構造での DNA の放出を特徴とする細胞死の一形態です 1,2。 NET は繊細で多様な性質を持っているため、NET の特性を評価するための具体的で簡単な手法の開発は困難でした 3,4。 多くの研究により、NET 形成が制御された異なる細胞死の形態であることが実証されています 2,5 が、他の細胞死経路とかなりの重複が存在しており、NET の正確な定義については議論中です 4。 DNA の凝縮と放出は、NET をアポトーシス、ネクロトーシス、パイロトーシスなどのプロセスと区別します。これらのプロセスはすべて核凝縮を引き起こします 6,7。 ただし、多くの細胞死経路の後期段階では核の破壊と DNA 放出が起こる可能性があり、エンドポイント分析を混乱させる可能性があります。 たとえば、アポトーシスの後に起こる二次壊死は、DNA の脱凝縮、細胞溶解、および細胞外内容物の放出を引き起こします 8、9、10。 さらに、細胞への生理学的損傷によって直接引き起こされる壊死など、制御されていない細胞死は、NET 形成と非常によく似た特徴をもたらす可能性があります 11,12。 どの経路が活性化されて細胞死を引き起こしているのか、潜在的な病理学的結果を軽減するためにどの経路を制御できるのか、細胞死が生理学的な損傷や細胞へのストレスの結果であるのかを理解するには、これらのタイプの細胞死を区別することが重要です。実験手順、または本物のプログラムされた細胞死経路です6。

NET の検出と定量は通常、細胞外 DNA 測定、細胞形態、タンパク質マーカーの組み合わせに依存しており、最も一般的なのはミエロペルオキシダーゼ (MPO)、好中球エラスターゼ (NE)、シトルリン化ヒストンです。 細胞外 DNA 測定では、PicoGreen2 などの蛍光色素を利用して、上清に放出された DNA を測定します。 Sytox Green などの不透過性 DNA 色素も NET の染色によく使用されますが、無傷の膜を持つ細胞は除外され、フローサイトメトリーなどの技術による定量が可能になります 13、14、15。 これらの技術は実装は簡単ですが、NET を他の形態の細胞死から区別できないため限界があります。 形態解析はこれを改善しますが、画像化とそれに続く手動計数または自動画像処理が必要です16、17、18、19、20。 これは手間がかかり、バイアスが生じる可能性があるため、精度を向上させるためにタンパク質マーカーが導入されることがよくあります。 イメージング技術を支援するだけでなく、タンパク質マーカーはサンドイッチ ELISA にも利用されます。このサンドイッチ ELISA では、タンパク質抗体 (通常は抗 MPO) を使用して NET が固定化され、DNA に対する抗体 (またはその逆) を介して検出されます。